第10章 吸光光度法
教学要点：
通过本章的教学使学生初步了解紫外-可见分光光度法研究的内容和特点，掌握单色光、复色光、吸收曲线、参比溶液、工作曲线、线性范围、吸光度、摩尔吸光系数、桑德尔灵敏度等基本概念，理解Lamber-Beer定律的基本原理，熟悉分光光度计的基本构造及光度分析法设计的基本步骤，了解光度分析法误差产生的原因，熟练应用光吸收基本定律解决光度分析法中的一般问题，掌握光度分析法的基本应用。
1．了解物质对光选择吸收原因及物质颜色及其互补关系规律
2．掌握光吸收定律各种数学表达式及其物理意义及吸收定律应用的基本限制。
3．了解光度分析误差产生原因，
4．明确显色条件和光度测量条件及参比溶液的选择。
5．掌握提高测定灵敏度和选择性的途径，定量分析的基本方法及应用
教学内容：
第一节 概述
第二节 光度分析法的设计
第三节 光度分析法的误差
第四节 其他吸光光度法和光度分析法的应用
教学重点和难点：
1. 光吸收的基本定律
2. 比色法和吸光光度法及其仪器
3. 光度分析法的设计
10.1 物质对光的选择性吸收和光吸收的基本定律
10.1.1 物质对光的选择性吸收
1．光的基本性质(波粒二象性)
光是一种电磁波，如果按照波长或频率排列可得电磁波谱图。
光具有二象性：波动性和粒子性。波动性是指光按波动形式传播。
例如：光的折射、衍射、偏振和干涉等现象，就明显地表现其波动性。光的波长入，频率υ与速度c的关系为：
λυ＝c
式中：λ以cm表示；υ以Hz表示；C为光速，在真空中等于2.9979×1010cm s -1，约为3×1010cm/s。
光同时又具有粒子性。光是由“光微粒子”(光量子或光子)所组成的。光量子的能量与波长的关系为：
E=hυ=hc/λ
式中：E为光量子能量，υ为频率，h为普朗克常数6.6262×10-34J·S。每个光子的质量为：
m=E/C2=hυ/c=c2
光子也具有动量，可以表示为：
mc=hυ/c=h/λ
不同波长(或频率)的光，其能量不同，短波的能量大，长波的能量小。
2．物质对光的吸收。
在光照射到某物质以后，该物质的分子就有可能吸收光子的能量而发生能级跃迁，这种现象就叫做光的吸收。但是，并不是任何一种波长的光照射到物质上都能够被物质所吸收。只有当照射光的能量与物质分子的某一能级恰好相等时，才有可能发生能级跃迁，与此能量相应的那种波长的光才能被吸吸。或者说，能被吸收的光的波长必须符合公式。
ΔE=hc/λ
这里，ΔE=E2-E1，表示某一能吸级差的能量。由于不同物质的分子其组成与结构不同，它们所具有的特征能级不同，能级差也不同，所以不同物质对不同波长的光的吸收就具有选择性，有的能吸收，有的不能吸收。
10.1.2 光吸收的基本定律——朗伯一比耳定律
1．朗伯一比耳定律
物质对光的吸收的定量关系，朗伯于1760年和比尔(Beer)在1852年分别阐明了光的吸收程度与液层厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为朗伯一比耳定律，也称光的吸收定律。
当一束平等单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿表面反射。设入射的单色光强度为I0，反射光强度为Ir，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，则它们之间的关系为：
I0=Ir+Ia+It
因为λ射光常垂直于介质表面射λ，Ir很小(约为λ射光强度的4％)又由于进行光度分析时都采用同样质料，同厚度的吸收池盛装试液及参比溶液，反射光的强度是不变的。因此，由反射所引起的误差可校正，抵消。故上式可简化为：
I0=Ia+It
当一束平行光垂直照射到厚度为b的溶液时，其光的强度的减弱的主要原因是溶液中的吸光质点(离子或分子)吸收了一部分光能。
这个关系式称为光吸收定律或比尔定律的数学表达式。
式中： －透光率或透光度，用T表示
－吸光度，用A表示，表示有色溶液吸收单色入射光的程度。
若溶液不吸收单色入射光，有I=Io，则
若溶液全部吸色收单色入射光，I=0，则 。
吸光度A与透光度之间的关系为：
k－吸收系数，表示吸光质点(分子、离子、or原子)对某波长光的吸收本领，与吸光物质的性质，入射光波长及温度等因素有关。k值随b和c的单位不同而不同。(当c的单位为g·l-1，b的单位为cm时，k以a表示，称为吸光系数，其单位为L·g-1·cm-1。此时：
A＝abc
朗伯－比耳定律的物理意义：当一束平行单色光垂直通过某溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及液层厚度b成正比。
2．灵敏度
(1) 吸光系数：
当液层厚度b以cm，吸光物质的广浓度c以g/L为单位时，系数k就以a表示，称为吸光系数。此时，朗伯－比耳定律表示为：
A=abc
此时吸光系数a的单位为L/g·cm。
(2)摩尔吸光系数
当液层厚离以cm，吸光物质浓度c以mol/L为单位时，系数k就以ε表示。ε称摩尔吸光系数。此时朗伯－比耳定律定为：
A=εbc
ε单位为L/mol·cm，其物理意义为：当吸光物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，某液液对特定波长的光的吸收能力。ε值愈大，表示吸光质点对某波长的光吸收能力愈强，故光度法则定的灵敏度就愈高。
最大吸收波长λmax下的摩尔吸光系数εmax是一个重要的特征常数。它反映了该物质吸光能力可能达到的最大限度，反映了用光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。
一般认为，如果εmax≥104，则用光度法测定具有较高的灵敏度，εmax≤103则为不灵敏，不宜用光度法进行测定。
(3) 桑德尔(E.B.Sandell)灵敏度
定义为：规定当仪器所能测出的最小吸光度(即仪器的检测极限)A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来吸光物质的最低含量。单位亦为：μg／cm2。
S与ε的关系
10.2 分光光度计及吸收光谱
10.2.1分光光度计
分光光度计的主要部件
1．光源
分光光度计所用的光源，应该在尽可能宽的波长范围内给出连续光谱，应有足够的辐射强度，良好的辐射稳定性等特点。
可见分光光度计的光源一般是钨灯，钨灯发出的复合光波长约在400~1000nm之间。
2．单色器
单色器是一种能把光源辐射的复合光按波长的长短色散，并能很方便地从其中分出所需单色光的光学装置。包括狭缝和色散元件两部分。色散元件用棱镜或光栅做成。
棱镜是根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光。然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。由于狭缝的宽度很窄，只有几个纳米，故得到的单色光比较纯。
光栅是根据光的衍射和干涉原理来达到色散目的。然后也是让所需波长的光经过狭缝照射到吸收池上，所以得到的单色光也比较纯。光栅色散的波长范围比棱镜宽，而且色散均匀。
3．吸收池(比色皿)
吸收池是由无色透明的光学波动或熔融石英制成的，用于盛装试液和参比溶液。比色器一般为长方形。有各种规格，如0.5cm、１cm、2cm等等。
4．检测器及数据处理装置
检测系统是把透过吸收池后的透射光强度转换成电讯号的装置，又称为光电转换器。分光光度计中常用的检测器是光电池，充电管和光电信增管三种。
10.2.2 吸收光谱
1．吸收光谱
吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小（A～λ关系）。
最大吸收波长 λmax：光吸收最大处的波长。
2．参比溶液选择
10.3 显色反应及其影响因素
10.3.1 显色反应和显色剂
1．选择显色反应的一般标准
(1) 选择性要好。一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应。或若干扰离子容易被消除，或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。
(2) 灵敏度要高。灵敏度高的显色反应有利于微量组分的测定。灵敏度的高低，可从摩尔吸光系数值的大小来判断。(但灵敏度高，同时应注意选择性)
(3) 有色化合物的组成更恒定，化学性质要稳定。有色化合物的组成若不符合一定的化学式，测定的再现性就较差。有色化合物若易受空气的氧化，光的照射而分射，就会引入测量误差。
(4) 显色剂和有色化合物之间的颜色差别要大。这样，试剂空白一般较小。一般要求有色化合物的最大吸收波长与显色剂最大吸收波长之差在60nm以上。
即：
2．显色剂
(1) 无机显色剂
许多无机试剂能与金属离子起显色反应，如Cu2+与氨水生成Cu(NH3)42+；硫氧酸盐与Fe3+生成红色的配离子FeSW2+或Fe(SW)52-等等。
(2)有机显色剂
许多有机试剂在一定条件下能与金属离子生成有色的金属配合物。它的优点有：
① 灵敏度高，大部分金属螯合物呈现鲜明的颜色，摩尔吸光系数都大于104。而且螯合物中金属所占比率很低，提高了测定灵敏度。
② 称定性好。金属螯合物都很稳定，一般离解常数很小，而且能抗辐射。
③ 选择性好。绝大多数有机螯合剂在一定条件下只与少数或某一种金属离子配位。而且同一种有机螯合物与不同的金属离子配位时，生成各有特征颜色的螯合物。
④ 扩大光度法应用范围，虽然大部分金属螯合物难溶于水，但可被萃取到有机溶剂中，大大发展了萃取光度法。
常用的有机显色剂有邻二氮菲、双硫腙、偶氮胂(Ⅲ)，铬天青Ｓ等，
10.3.2 影响显色反应的因素
1．溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δλ；影响待测离子的存在状态，防止沉淀；影响络合物组成。
2．显色剂的用量
3．显色反应时间
4．显色反应温度
5．溶剂
6．干扰离子的影响
10.4 吸光光度分析及误差控制
10.4.1 测定波长的选择和标准曲线的制作
1．测定波长的选择
2．标准曲线的制作
10.4.2对朗伯-比尔定律的偏离
1．非单色光引起的偏离
在光度分析仪器中，使用的是连续光源，用单色器分光，用狭缝控制光谱带的密度，因而投射到吸收溶液的入射光，常常是一个有限宽度的光谱带，而不是真正的单色光。由于非单色光使吸收光谱的分辨率下降，因而导致了对朗伯－比耳定律的偏离。
为了克服非单色引起的偏离，应尽量设法得到比较窄的入射光谱带，这就需要有比较好的单色器。
2．介质不均匀引起的偏离
朗伯－比耳定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果溶液不均匀，例如产生胶体或发生混浊，就会发生工作曲线偏离直线。当λ射光通过不均匀溶液时，除了被吸光物质所吸收的那部分光强以外，还将有部分光强因散射等而损失。
3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离
离解、缔合、异构等。
4．显色反应的干扰及其消除方法
克服方法：
控制溶液酸度、加入掩蔽剂、改变干扰离子价态、选择合适的参比溶液、增加显色剂用量、分离。
10.4.3吸光度测量的误差
A=0.434或T=0.368时，相对误差最小。
10.5 其他吸光光度法
10.5.1 目视比色法
10.5.2 示差吸光光度法
朗伯－比耳定律可表示为：
ΔA=εbΔc
10.5.3 双波长吸光光度法
10.5.4 导数光度分析法
10.6 吸光光度分析法的应用
10.6.1 痕量金属分析
10.6.2 临床分析
10.6.3 食品分析
10.6.4 其他应用
